《mRNA-LNP疫苗的結構與穩定性》文獻解讀系列七

文章來源:AVT發布時間:2021-09-07瀏覽次數:

改善保質期和儲存條件的機會

當需要冷凍以保持疫苗穩定時,終端使用的流通、儲存和處理是有嚴格標準的,成本會相應增加。為了便于流通,疫苗在2–8 °C 下能夠保持穩定將是理想的保存條件。在下一節中,我們將專注于研究如何實現這種儲存條件,因為這些被視為大規模使用mRNA 疫苗(例如在大流行中)的瓶頸。


4.1 . 輔料

上一節關于mRNA疫苗穩定性的結論是,為了制造更穩定的mRNA-LNP疫苗,穩定mRNA是首要目標。顯然,用于mRNA 的疫苗制劑的任何輔料都必須不含RNase。Muralidhara等人的綜述中總結了大量有關輔料和制劑環境的影響。


Muralidhara等人提出的一些輔料,Moderna 和 Pfizer/BioNTech 已經將其用于mRNA 疫苗。制劑中的輔料用作緩沖劑、滲透壓調節劑和冷凍保護劑或具有雙重作用。例如,Moderna 使用 Tris-HCl 緩沖液,它對核酸大分子具有額外的穩定作用,因為Tris-HCl也是一種羥基自由基清除劑。選擇這些輔料時,應考慮產品可能需要在低于零的溫度下儲存,而輔料會受到冷凍的影響。緩沖系統和滲透壓調節劑的選擇很重要,因為冷凍后 pH 值可能會發生變化,如磷酸鈉鹽組成的緩沖系統,冷凍時pH會出現 3.5 個pH 單位的下降(在磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉組成的緩沖體系中,磷酸氫二鈉的溶解度會隨溫度的降低急劇降低,導致緩沖體系中磷酸氫二鈉濃度大幅度下降,體系pH也隨之發生大幅度降低)。


組氨酸緩沖液在冷凍時pH波動則很小,但是,當從 0°C 下降至 -30°C 時,pH值依然可能會下降 0.5個pH單位。此外,NaCl(滲透壓調節劑)溶液的共晶溫度為 -21 °C,可以添加一些其他輔料比如抗氧化劑、非還原性自由基清除劑(例如乙醇)或金屬螯合劑。然而,我們選用輔料時需要納入考慮這些輔料在0°C 以下或0°C以上時能多大程度地改善mRNA-LNP 制劑的穩定性。


pH優化對于mRNA 疫苗的穩定性也很重要,因為 pH 會影響 mRNA 的水解速率和LNP穩定性。通常,mRNA 在弱堿性環境中穩定。Moderna 和 Pfizer/BioNTech 疫苗的 pH 值均在 7 到 8 之間。Wayment-Steele 等人指出陽離子脂質完全帶正電時表面的pH值可能高于周圍的水介質。


4.2 . 凍干

由于水的存在會引發 mRNA-LNP 的降解反應,因此凍干將是提高 mRNA-LNP 制劑長期穩定性的可行途徑。輝瑞病毒疫苗研究負責人Philip Dormitzer 已經提到輝瑞希望將凍干技術用于 mRNA-LNP疫苗。此外,Moderna公司的凍干形式的巨細胞病毒mRNA疫苗(mRNA-1647) 已進入2期臨床試驗,公司宣稱該疫苗在5 °C 保存的保質期≥ 18 個月。但是,目前在公開資料中找不到有關該制劑方和生產工藝的詳細信息。


冷凍干燥廣用于病毒滅活疫苗,關于冷凍干燥技術應用于mRNA制劑也進行了相關研究,證明了冷凍干燥可以提高mRNA的穩定。瓊斯等人的研究表明,用海藻糖配制的凍干mRNA在4°C下可穩定儲存長達10個月。脂質納米顆粒也可以被成功冷凍干燥,在冷凍干燥過程中,結構可能會被改變,因此制劑中應包含穩定這些膠體顆粒的凍干保護劑,蔗糖或海藻糖常用于凍干保護。對mRNA 或 LNP 的研究表明,凍干可能是提高mRNA-LNP 穩定性的一種可行方式,能夠使mRNA-LNP疫苗在更高的溫度下儲存。然而,凍干也有其缺點,因為凍干制劑需要在給藥前重新配制,并且凍干工藝是一個相對昂貴、耗能和耗時的過程。另一方面,保持 mRNA 疫苗深度冷凍也是有代價的,因此下一步應當研究凍干提高mRNA-LNP 制劑穩定性的可行性。


Shirane等人將含乙醇的siRNA-LNP制劑凍干后再進行復溶,隨后用復溶的制劑和新鮮制備的(通過超濾去除乙醇)的制劑分別給藥,動物體內的基因敲除效率沒有差異。這些研究結果在一定程度上表明了mRNA-LNP 凍干的可行性,同時也應當考慮研究中所用的siRNA和mRNA之間存在差異。


關于mRNA-LNP 凍干研究的公開數據很少,但趙等人近發表了一篇論文,研究 mRNA 脂質納米粒。他們研究了這些含有可電離陽離子脂質的納米顆粒的冷凍干燥效果,文章中沒有提供冷凍干燥過程的細節。與Shirane 等人獲得的 siRNA-LNPs 數據相反,他們發現凍干前和凍干復溶后,體外測試顯示活性沒有損失,但體內活性卻有所下降。因此,mRNA-LNPs 的冷凍干燥可能比研究報道的更為困難,闡明體內活性下降背后的機制將是十分重要的??赡苁桥浞讲贿m合冷凍干燥,或者凍干過程本身存在缺陷,作者推測可能是凍干導致mRNA-LNP納米結構的改變導致體內活性下降,因為這種改變可能會影響mRNA-LNP微粒與血清蛋白結合的特性,而這些特性在體外研究中是無法顯示的。因此,進一步改進制劑方和冷凍干燥工藝可能會達到較優的mRNA-LNP凍干效果。


另一種方法,如果mRNA-LNPs的凍干有問題,可以改成單獨凍干mRNA并在給藥前與 LNPs 結合。Ball等人用了相反的方法,他們通過用siRNA的乙醇溶液與冷凍干燥后復溶的LNP結合。他們終總結到:“向復溶后的LNP溶液中加入乙醇既不方便也不實用,因為在用于動物或臨床之前需要透析除去乙醇”。Leavit等人發現將mRNA凍干復溶后與空白LNP混懸液混合, mRNA 被LNP包封,給藥結果顯示mRNA依然具有活性。


除了需要在凍干過程中保持 mRNA-LNP 的完整性之外,凍干工藝還有其他局限性,例如該凍干過程高能耗和需要其他成本,在疾病大流行時,在全球范圍內急需的凍干產能無法在短時間得到滿足。因此需要考慮替代的干燥技術,關于mRNA-LNP 的噴霧干燥研究只能找到一篇文獻,該噴霧干燥過程需要聚合物(例如 Eudragit)作為 mRNA-LNP 的穩定劑以確保體內活性。超臨界干燥技術也是冷凍干燥的另一種可替代選擇;它們已被證明適用于其他生物大分子的干燥,如蛋白類藥物。


結論和前景


本綜述概述了不同因素如何影響mRNA 疫苗在其儲存過程中的穩定性。我們得出的結論是,mRNA暴露于水可能是mRNA 疫苗不穩定的主要因素。這意味著減少與水的接觸將是提高 mRNA 疫苗穩定性的一種有效的方法。


對mRNA-LNP結構的研究表明,mRNA與可電離的陽離子脂質和水一起位于LNPs的核,這是mRNA可能屏蔽水的重要證據。當前尚不清楚LNP 中的可電離陽離子脂質是否以及如何與mRNA相互作用,這需要更多的研究工作來確認LNP內部結構。LNP內部的pH值已被確定為與其穩定性密切相關。另一個需要研究的問題是專門分析 mRNA 分子的降解類型,以及序列調整是否有助于維持鏈的完整性。這也可以與 mRNA 的二級和三級結構的表征和優化相結合,因為有跡象表明一些折疊結構更為穩定。


本報告是對 mRNA-LNP 疫苗不穩定性背后的因素的文獻綜述,還指出了規避這些不穩定性因素的解決方案,從而開發出能耐受更高儲存溫度的mRNA-LNP疫苗,從而解決當前疫苗流通過程所需儲存條件苛刻的問題。


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