核酸藥物遞送系統——脂質納米顆粒(LNP)

文章來源:AVT發布時間:2021-08-23瀏覽次數:

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脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的主要作用是攜帶和傳遞遺傳信息。這兩類分子能夠用于疾病的預防、診斷和zhi療的,就是核酸藥物。核酸藥物包括反義核酸(ASO)、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小ji活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)適配體(aptamer)、核酶(ribozyme)、抗體核酸偶聯藥物(ARC)等,是基因zhi療的一種形式。核酸藥物的優點是可以簡單地通過重新排列A,G,C,T(U)的序列而成為新的藥物。核酸藥物能夠以化學藥物或抗體藥物無法靶向(例如mRNA和miRNA)的分子作為作用靶點,有望對傳統藥物療效不佳的疾病產生突破性的進展,比如難以zhi療的遺傳疾病、ai癥以及某些病毒感(例如SARS-CoV-2)。近期FDA宣布新指南鼓勵基因zhi療(包括核酸藥物)創新。諾華、默沙東、輝瑞制藥、藥明康德等多家藥企在該領域進行了重要的布局。


由于疫,mRNA疫苗、核酸藥物等獲得了更多的關注?,F在mRNA疫苗、核酸藥物多是采用脂質納米顆粒(LNP)來實現對mRNA等核酸分子的遞送的,輝瑞、Moderna等上市的mRNA疫苗以及早的RNA類藥物onpattro都是采用了脂質納米顆粒來遞送各自的核酸藥物。本文綜述了脂質納米顆粒在核酸藥物遞送的作用,組成,關鍵輔料,制備工藝等方面。


1.核酸藥物傳遞系統是關鍵


核酸藥物的開發主要面臨三大問題:

1.1.核酸分子在體內不穩定性;

1.2.核酸分子潛在的副作用;

1.3.核酸藥物遞送系統開發難度大。


這其中重要的是遞送系統的研發。核酸藥物在其注射進入人體后,如何存留足夠時間以準確靶向到病變部位,同時避免損傷正常細胞,必須是研發出高效安全的藥物遞送系統,以解決核酸藥物遞送、穩定性、脫靶效應等難題。遞送系統可分為病毒載體和非病毒載體,病毒載體在基因zhi療中應用較多,但由于其免疫原性、致瘤性、和有限的載藥量(loading capacity)使得其在核酸藥物中應用相對較少;而非病毒載體應用相對更多,如聚合物類(polymer)、脂質類(liposome或LNP);且可以將核酸藥物與特定的配體結合使其能夠靶向特定的細胞,如GalNAc、多肽、抗體等。LNP是目前核酸藥物研究應用多的遞送系統之一,LNP能夠安全而有效地遞送核酸。目前已經有使用LNP的核酸藥物獲批,例如Alnylam公司獲批的siRNA藥物Onpattro。LNP是目前比較成熟的一個技術平臺,用來遞送RNA藥物、疫苗或基因編輯工具。相對其他類型的核酸藥物遞送系統而言,LNP具有很多優勢,比如核酸包封率高并且能夠有效轉染細胞,組織穿透性強,細胞毒性和免疫原性低,更有利于遞送藥物等優勢,這些優勢使LNP成為出色的核酸遞送系統。


2.核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的組成


有一些公司在核酸遞送系統的脂質配比上是非常相似的,LNP的方中可離子化陽離子脂質占50%,剩下10%是中性脂質,38-40%是膽固醇。脂質納米顆粒(LNP)模擬細胞膜形成細胞,直徑只有100納米左右,成分包括中性脂質、陽離子脂質、膽固醇、PEG-脂質。核酸藥物與普通化學藥物的明顯區別是核酸有數量龐大的磷酸根,因而呈負電,使用可離子化陽離子脂質的LNP可以更好的包裹核酸藥物。陽離子脂質有一個帶銨根的親水端,在酸性下與氫離子結合呈正電,借助兩者的靜電吸附,就能夠將核酸包裹在脂質納米粒中。當LNP被細胞內吞后,可離子化陽離子脂質會在酸性環境下離子化,破壞內涵體膜,從而實現LNP的內涵體逃逸。LNP還可以設計成特異性結合載脂蛋白如APOE3,APOE3會將LNP帶到肝臟,LNP和肝細胞表面受體結合后通過細胞內吞作用釋放藥物,起到靶向肝細胞的目的,包裹后的LNP外殼因陽離子脂質的疏水端向外而呈疏水性,此時可以加入傳統脂質體合成中常用的一端修飾有PEG的脂質——PEG-脂質,使PEG-脂質的疏水端與陽離子脂質的疏水端結合,而PEG-脂質的親水端(連有PEG)則向外形成核酸脂質納米粒的外殼。為了增加核酸脂質納米粒的穩定性,還可以添加適量的膽固醇等成分,使PEG-脂質的疏水端與陽離子脂質的疏水端結合更為緊密,得到核酸脂質納米粒的成品。


3.核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的關鍵輔料


核酸遞送脂質納米顆粒一般由以下輔料組成:


3.1.陽離子脂質:與帶負電的 mRNA 結合,可高效包載核酸藥物,同時提供正電荷,與帶負電荷的mRNA復合,有助于內涵體逃逸,mRNA體內轉染,可離子化脂質具有pH敏感性。具體產品有DOTAP,Cl,DLin-MC3-DMA,DC-CHOL等。


3.2.膽固醇:穩定LNP結構,調節膜流動性,提高粒子穩定性。


3.3.輔助型脂質:常用DOPE,穩定粒子,破壞內涵體穩定性,提高核酸遞送效率。


3.4.聚乙二醇化磷脂:提高粒子穩定性,減少粒子在體內與血漿蛋白的結合,延長體循環時間。例如DMG-PEG2000,DSPE-MPEG2000(藥用注射級)等。


3.5.穩定劑蔗糖或海藻糖,提高LNP和mRNA疫苗的穩定性,防止脂質黏性過大。


4. 核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的氮磷比計算


在核酸脂質納米顆粒合成時,正電荷與負電荷的數量比將影響到納米粒子的穩定性、電位等性能。正電荷通常為具有可電離銨根(N)的陽離子脂質,而負電荷則為帶有大量磷酸根(P)的核酸分子,兩者可通過靜電吸附的方式結合在一起。兩者不合理的比例可能會導致粒徑過大、穩定性差等缺陷,正確計算正電荷與負電荷的比(N/P比)是非常重要的。在實際應用中,也可以先定下N/P比,再確定有機相或水相的濃度,此時只需要逆向計算即可。


5. 核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的制備


目前常用的脂質納米顆粒制備方法主要有薄膜水化法、擠出法、均質法等。有報道采用微流控混合技術來制備核酸脂質納米顆粒,該方法相對簡便快速,條件溫和,同時容易實現生產放大。通過不同生產規模的微流控機器,可以較好的實現mRNA-LNP的良好制備,其結果一致性良好,粒徑結果合適,且具有極低的PDI值,證實其分散性較好,并且包封效果可達90%以上。通過微流控技術高效、可放大的制備核酸脂質納米粒,每小時可生產20升。


微流控技術基本原理:將脂質與核酸分別溶解在水相和有機相后,將兩相溶液注入制備系統的兩條入口通道,一端是RNA的水溶液,一端是脂質的乙醇溶液,通過兩相的快速混合,完成核酸脂質納米顆粒的合成。 改變流體注入速度和比率,可以控制脂質納米顆粒的粒徑大小。


也有文獻報道采用類似于微流控技術的沖擊式射流混合法可以實現大生產,利用 BlueShadow 80P 高壓泵,讓疫苗和脂質溶液形成兩股射流,在腔體中進行對沖,利用流體動力學讓脂質各個組分充分地混合,形成包裹mRNA的納米脂質體顆粒。生產設備碰撞噴射混合器安裝在潔凈間(C級)內,通過中控平臺控制工藝步驟中所有單元的流量。所有單元安裝在不銹鋼框架內,以適應藥品生產中的 CIP清潔程序。該系統包括:KNAUER 碰撞噴射混合器(IJM), 脂質/乙醇混合物和 mRNA/緩沖液混合物的入口管路,脂質體出口管路,CIP在線清潔系統和不銹鋼框架。


6. 核酸遞送脂質納米顆粒(LNP)的專li


mRNA核酸技術起源于20多年前,主要來自UBC和UPenn。后面發現LNP可以很好的解決mRNA成藥,所以針對LNP專li產生了很多的授權。在陽離子LNP的專li上,一般小核酸領域的企業的專li布局結構為:由母案保護重要的脂質制劑活性成分,分案保護脂質制劑和zhi療性siRNA的組合,同時由于美國申請存在期限調整的制度,大廠會利用多重專li申請在一定程度上獲取不同的延長期限以延長專li對于產品的保護期。因此,在Arbutus前身Tekmira對于MC3脂質體專li進行了詳盡保護的前提下,除非對于陽離子脂質設計進行極大變革,很難突破陽離子脂質體專li壁壘。但可以通過替換 LNP 中的其他脂質,規避陽離子脂質的專li壁壘,例如麗凡達生物用陰離子脂質DOPS 替代了 輝瑞和 Moderna 方中的中性脂質 DSPC。


目前國內也發布了一種新型陽離子脂質體專liCN201310099727.5,該專li包含陽離子脂質體核酸類藥物制劑及其制備方法和用途。陽離子脂質體方主要包含陽離子脂質,輔助磷脂,聚羧基甜菜堿脂質分子和冷凍保護劑。該專li涉及的陽離子脂質體克服了陽離子脂質體毒性高,血液穩定性差和轉染效率低的缺點,有效地提高了核酸類藥物的藥效,同時由于該制劑使用時不受血清干擾,因此簡化了實驗和zhi療中操作。


7.核酸遞送脂質納米顆粒國內發展的問題


對于核酸藥物,LNP與其他遞送系統相比,其包封效果、體內外表達效果、體內安全性等多方面都更具優勢,可以說脂質納米顆粒(LNP)是佳的遞送系統。國內已有多家企業,例如瑞博生物,艾博生物,斯微生物,麗凡達生物, 圣諾生物等均投資研發核酸藥物脂質納米顆粒遞送系統關鍵技術。據報道2020年廣州銳博生物技術有限公司投資1016萬元,建設核酸藥物脂質納米顆粒遞送系統關鍵技術研究平臺,開展核酸藥物體內遞送系統關鍵技術開發。


但有三大難題依然制約國內脂質納米顆粒技術的發展:


1.輔料的缺乏,脂質納米顆粒輔料的研發,輔料國產化;


2. 缺乏成熟的工業化生產設備;


3.缺乏既懂得制劑學和高分子材料學,又懂得制藥工程設備的人才;


如上所述,脂質納米顆粒LNP作為非常有前景的核酸藥物載體,在制藥行業已備受關注。特別是現在,LNP是mRNA疫苗的關鍵技術,在有效保護mRNA并將其運輸到細胞當中發揮著舉足輕重的作用。同時LNP也應用擴展到其他領域,比如醫學影像、化妝品、營養品、農業以及納米反應器等。隨著新輔料的發現,制備工藝的創新改進,LNP會表現出更復雜的內部結構和更優的物理穩定性,未來將會看到更多基于LNP遞送的核酸藥物上市,為腫liu等多種疾病提供zhi療方案。



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參考文獻:

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