艾偉拓分享:針對病毒感染和多種腫瘤的RNA類疫苗也已經進入臨床前期和臨床試驗階段

文章來源:AVT發布時間:2020-08-28瀏覽次數:

 本期艾偉拓給您分享RNA類藥物以及疫苗的研究進展,針對病毒感染和多種腫瘤的RNA類疫苗也已經進入臨床前期和臨床試驗階段,感興趣的小伙伴速來圍觀!

 以mRNA和RNA病毒為基礎研制的藥物和疫苗展現出巨大潛能并能在細胞質內直接翻譯而減少染色體整合。但其應用仍受RNA降解相關的轉運及穩定性問題的限制?;赗NA類藥物的臨床試驗已經在多個疾病領域展開。同時針對病毒感染和多種腫瘤的RNA類疫苗也已經進入臨床前期和臨床試驗階段。RNA轉運和穩定性的提升,包括RNA結構改造,靶向樹突狀細胞和自體擴增RNA的應用。單鏈RNA病毒包含自體擴增RNA,使它可以在細胞質中產生大量RNA復制體來支持RNA類藥物和疫苗的發展。盡管寡核苷酸類方法也展現了其潛力,但在這篇文章中我們主要關注以mRNA和RNA病毒為基礎的方法。

 藥物發展長期以來被療效不佳,不良反應和高昂費用等問題困擾。因此,藥物研發的新方法一直很受重視。RNA為基礎的方法為研制靶向針對受累細胞的藥物和針對免疫反應刺激細胞的疫苗提供了優勢。臨床試驗中,RNA藥物在治療眼部疾病,心血管疾病和多種腫瘤方面有所成效。同時,已經證實在動物模型中RNA疫苗對致死劑量的埃博拉病毒和腫瘤細胞有保護作用。

 背景介紹

 現代藥物研制因轉運不充分,藥物療效和安全等問題而無法改進或發明新藥。相比傳統制藥方法,小分子藥物和生物療法的發展以及將核酸的應用有很大的發展潛力。這篇文章中,胞質DNA和寡核苷酸類藥物也有所涉及。然而,近期技術發展為應用RNA類藥物的研制創造了可能。直接方法包括將以在靶細胞內迅速翻譯來表達有治療效果基因的療效或者生成可以用來制作疫苗的抗原為目的mRNA注入細胞。由于RNA序列的出現,轉運進入細胞的轉錄片段因被快速降解而只能得到非常有限的暫時轉錄表達并且削弱了療效。為提高RNA的穩定性,我們付出了很大的努力。同樣,轉運RNA的問題也備受關注,轉運的方法包括:用磷脂分子、聚合物或者納米粒子來包裹RNA分子以及靶向樹突狀細胞(DCs)也就是抗原呈遞細胞。另一種方案中,以RNA病毒為基礎的自體擴增RNA也應用于RNA的轉運。在這篇綜述中,將會介紹用于實現RNA穩定性,轉運和擴增各種方法。并且也會討論到最新的RNA類藥物和疫苗的進展。這篇綜述將會集中論述mRNA和RNA病毒類藥物和疫苗而不會涉及寡核苷酸類治療方法。

 一、RNA穩定性的提升

 由于單鏈RNA(ssRNA)對降解的敏感性,我們為了提高RNA分子的穩定性做了很多努力。包括將經過證實具有穩定mRNA分子和啟動翻譯的序列進行改造。并且化學改造核苷也可以增強對降解的抵抗。

 1、帽結構

 5‘端7-甲基鳥苷三磷酸(m7G)的帽結構對RNA穩定性起到很關鍵的作用。盡管帽結構已經應用于體外RNA轉錄,但因帽結構反向匹配結合后導致不能有效的轉錄生成mRNAs依然是一個問題。用只有一個3’-OH群的抗反向帽結構(ARCAs)來代替兩個3’-OH群的帽結構就可以防止反向匹配結合的問題。與傳統帽結構相比,應用ARCAs使RNA 轉錄效率提高了兩倍以上。并且,有ARCAs帽結構的體外轉錄RNA轉染進入細胞后RNA表達蛋白質的持續時間和水平都有明顯提高。由于無法到達100%的加帽率,轉錄后再加帽結構的方法已經被應用來提高未加帽結構RNA的翻譯效果。近期研究發現一些細菌RNA 片段在5’末端也有類似真核細胞RNA帽結構的結構。并且在革蘭陰性和革蘭陽性細菌中都發現了5’端的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和3‘端的脫磷輔酶(dpCoA),我們假設脫氫NAD+(NADH)和dpCoA在RNA轉錄起始后像帽結構一樣被加在RNA上的。然而,最新的研究表明在NAD+,NADH, dpCoA 是在RNA轉錄起始階段整合到RNA上的。它們被認為是在細胞RNA多聚酶(RNAP)重新啟動轉錄的非經典核苷酸啟動因子(NCINs)。并且細菌RNAP和真核細胞RNAPⅡ都整合了NCIN帽結構。NCIN帽結構的效率與DNA啟動子上游及所處的轉錄起始點序列有關。而且NCIN帽結構在體內是功能序列。這些發現對未來更好的轉運和表達RNA的穩定性有很大的助益。

 2、Poly(A)尾

 另一種穩定RNA分子的方法是在mRNAs3‘端加poly(A)尾。已經證實poly(A) 尾和5‘端m7G帽結構通過結合PABP起協同作用。PABP與真核細胞翻譯啟始因子eIF4G相互作用并和5’端m7G帽結構、真核細胞翻譯啟始因子eIF4E共同構成復合物。Poly(A)尾可以通過將含poly(A)尾基因的片段編輯在DNA模板上或利用重組poly(A)多聚酶在體外轉錄RNA完成轉錄后延長生成這兩種方法加在mRNAs上。其中利用重組poly(A)多聚酶的方法缺點是生成的poly(A)尾的長度不一。相比之下,利用DNA模板生成的poly(A)尾因具有一定的長度從而成為最佳選擇。就poly(A)尾的構建而言,已經證實了增加poly(A)尾的長度可以提高形成多聚體的效率同時也會影響蛋白質表達的水平?;诙鄠€研究可以得出體外轉錄mRNAs最適宜poly(A)尾的長度在120-150個核苷酸左右。

 3、5’和3’端非翻譯區

 非翻譯區(UTRs)對基因表達的轉錄后調節起著非常重要的作用。它包括調節mRNA從核內的轉運和翻譯的效率,亞細胞定位和mRNA穩定性。并且,非翻譯區,尤其是3‘端UTR的保守莖環結構和硒代胱氨酸插入序列也與mRNA中硒代胱氨酸密碼子UGA翻譯成硒代胱氨酸有關。從5‘端和3‘端插入非翻譯序列就擁有了關鍵調節基團便可以優化體外mRNA的轉錄。alpha球蛋白3’端UTRs的整合經證實確有穩定mRNA的作用。況且5‘端和3’端的β球蛋白UTRs還可以提高翻譯效率。球蛋白UTRs已經被應用于優化體外RNA轉錄包括RNA自體T細胞電穿孔技術和裸抗原編碼的RNA結內注射技術。并且,被轉染了抗原表達UTRs優化的RNA的樹突狀細胞(DCs)已經被用來免疫CMV陽性的個體和腫瘤病人了。

 4、化學改造核苷

 為了提高RNA的治療效果,在RNA翻譯后整合天然核苷已經在體外試驗中證實可以有效地減少轉錄RNA引起的免疫反應。例如,由假尿苷改造過的體外轉錄mRNA可以提高RNA的穩定性和翻譯效率。盡管RNA可以通過激活Toll樣受體來刺激免疫系統,但是整合改造的核苷(甲基化或假尿苷)會降低其激活能力,最終導致樹突狀細胞(DCs)內細胞因子的嚴重下降和生物標記物低活性。因此這種方法會導致TLR3,TLR7,TLR8識別障礙并且誘發抗體外轉錄RNA的免疫反應。因此,為了增強和延長mRNA的翻譯,高效液體色譜法純化的體外轉錄mRNA被用于清除dsRNA污染物,這樣可以減少type1IFN和炎癥前細胞因子的產生。

 二、RNA轉運

 難以實現有效的RNA轉運的問題已經嚴重阻礙了RNA在藥物和疫苗的發展。為此,許多方法都試圖提高RNA的轉運效率,主要包括優化注射法,基因槍轉運法,魚精蛋白濃縮法,RNA佐劑,多聚體和脂質體納米粒子包裹RNA等方法。

 1、裸RNA

 最簡單的應用包括肌內注射裸mRNA,最初在小鼠體內導致報告基因的表達。后來用癌胚抗原(CEA)mRNA免疫小鼠使其產生抗癌胚抗原抗體的免疫反應,讓裸RNA應用可行性得以肯定。盡管在一系列動物模型研究中都可以誘發產生抗體和T細胞免疫反應,但因特異性RNA酶對RNA的迅速降解使這項技術應用受限。許多用于提高轉運效率的辦法都在實驗中,包括應用基因槍將RNA直接注入細胞質中。由金粒子包裹的體外轉錄mRNA可以穿過細胞膜。在一個小鼠模型中用基因槍轉錄連接了EGFP(增強綠色熒光蛋白)的黑色素細胞自身抗原TRP2的mRNA誘導出了抗原特異性細胞和體液免疫反應并且為機體對抗B16黑色素瘤肺部轉移灶提供了保護。另一種方法是魚精蛋白濃縮的mRNA,它可以保護RNA免于降解,并且通過MyD88,TLR7和TLR8依賴的信號通路誘導免疫反應。濃縮魚精蛋白用于刺激產生抗原特異性的IgG抗體并激活特異性細胞毒性T淋巴細胞免疫反應。然而,給轉移性黑色素瘤病人皮內注射濃縮魚精蛋白mRNA在1/2的評價病人中是安全的并且提高直接免疫的T細胞的數量,而在1/7患有疾病的病人中有完全反應。

 2、佐劑和共刺激分子

 在許多疫苗應用中已經證實添加佐劑實質上可以增強免疫反應。已經發現裸mRNA自身就使一種佐劑因此它可以刺激免疫反應。其他分子例如魚精蛋白,多聚體Ⅰ:CRNA和包含基序的CpG都有為mRNA類疫苗增強免疫反應的效果。其他方法主要是將CD40L,CD70, OX40L, GITR和CD83共刺激分子序列整合在mRNA上來進一步增強免疫反應。

 3、包裹RNA和靶向樹突狀細胞(DCs)

 為了增強RNA的轉運率和穩定性,已經評價了許多包裹RNA轉運方案。在這種情況下,陽離子脂質體如N-[1-(2,3二油氧基)丙醇]-N,N,N-三甲基氯化銨1(DOTAP)已經被應用于包裹RNA。納米顆粒已經證實可保護mRNA免受核酶降解并可以增強細胞對mRNA的攝取。近期已經可以用pH依賴性多-(b-氨基酯)核心和磷脂殼制造出可完全降解的納米粒子。有效的納米粒子體內mRNA轉運已經成功在動物模型中誘導產生了強烈的免疫反應。例如,由DOTAP脂質體包裹的OVA mRNA分子通過皮內注射進小鼠的耳廓保護其不受EG7-OVA細胞皮下腫瘤的侵害。潛在的粒子聚集導致的細胞內外基因轉運減少現象或許可以解釋為什么CTL(細胞毒性T細胞)對靜脈內注射反應比皮內注射反應更強烈。同時也證實了整合有融合基因特性的輔助脂質體DOPE可以將CTL對DOTAP/DOPE包裹的mRNA的免疫反應相較于DOTAP脂質體包裹的mRNA的免疫反應提高4倍。將OVA mRNA和GM-CSF mRNA共轉運可以增強CTL的免疫反應。相比之下,CD80和IL-2的協同刺激卻并沒有這種效果。另一個實驗中選擇用組織化脂質來運送mRNA。通過組織化脂蛋白復合物系統性轉運黑色素瘤相關抗原MART1的mRNA可以特異性保護機體不受B16F10黑色素瘤的侵害。其中組織化脂蛋白復合物是由聚乙二醇化的組化聚賴氨酸和L-組氨酸-乙酰胺組成的。增強性的抗B16免疫反應是通過使用同時包含MART1和MART1-LAMP1的mRNAs獲得的。

 樹突狀細胞(DCs)是專門的抗原呈遞細胞,在刺激產生免疫反應的過程中起著非常重要的作用。因此靶向樹突狀細胞為增強體內免疫反應提供了可能。然而早期研究證明,樹突狀細胞不能很好的被脂質復合體轉染。因此納米顆粒就被用于增強靶向樹突狀細胞(DCs)的功能。說到腫瘤免疫,樹突狀細胞(DCs)可以被腫瘤相關抗原(TAAs)的mRNA或者整個腫瘤的RNA轉染。轉染了TAA mRNAs的樹突狀細胞(DCs)可以直接被用于研制疫苗而不需要利用病人特異的腫瘤細胞或抗原。這個方法的缺點一方面在于許多腫瘤缺乏特異性的TAAs另一方面在于并不是所有TAAs都可以誘導出有效的免疫反應,故選擇特異性TAAs也是一個難題。許多有關TAA mRNAs的研究都誘導出了抗腫瘤免疫反應。例如,轉染了前列腺特異性抗原(PSA)TAA mRNAs的樹突狀細胞(DCs)被用于治療前列腺癌病人,其誘導出了PSA特異性T細胞免疫反應且大大降低了6/7病人體內的PSA水平。并且用CEA mRNA 轉染的樹突狀細胞(DCs)誘導的免疫反應在胰腺癌病人中耐受良好,盡管只在1/4的病人體內誘導出了抗腫瘤免疫反應。另一個試驗中,甘露糖組化脂質復合體納米粒子被應用于提高樹突狀細胞(DCs)中mRNA的轉染效果。靜脈注射mRNA裝載的人(11)-LPR100比無糖LPR100誘導樹突狀細胞表達EGFP效率高4倍。樹突狀細胞(DCs)轉染效果提高與抑制B16F10黑色素瘤的生長和注射免疫MART1 mRNA裝載的人(11)-LPR100后病人生存期延長現象都有關系。針對腦腫瘤,肺腫瘤,腎腫瘤和黑素色瘤等腫瘤,利用從病人體內獲得的完整腫瘤RNA的方法已經進入臨床試驗階段。在這種情況下,在大約1/3參加試驗的腦腫瘤和神經母細胞瘤病人體內中觀察到了臨床反應。并且,在患有腎臟惡性腫瘤病人的試驗中并未觀察到劑量相關的毒性反應或自身免疫反應。

 三、自體擴增RNA

 單鏈RNA(ssRNA)病毒鑒于其可以自我復制的特性,被頻繁應用于研發疫苗和腫瘤免疫治療。所有RNA病毒中,α病毒,黃病毒,重組病毒及麻疹病毒已經作為RNA的轉運和表達向量。下面簡單介紹一下這些病毒。

 α病毒屬于包膜病毒,包含一條正鏈RNA基因組和包膜結構。其中非結構基因nsP1-4,專門負責高效RNA復制,可以讓RNA分子快速擴增而使正鏈RNA可直接在細胞質內翻譯。在體內和體外試驗中,復制率低的α病毒和復制率高的a病毒都被用于基因轉運。并且這些病毒向量可以有多種形式的運用,如重組病毒顆粒,裸RNA復制子或層型RNA-DNA病毒矢量。同樣,有著單正鏈RNA基因組的黃病毒和α病毒以同樣的原理應用于腫瘤免疫治療。相比之下,重組病毒和麻疹病毒是單負鏈RNA基因組,這使它們需要通過另一種方法來生成病毒矢量。但這并沒有限制它們在疫苗研發或免疫治療方面的應用。自體擴增RNA病毒矢量近來被廣泛應用于感染性疾病和腫瘤疫苗的研制。例如,用重組庫金病毒(黃病毒屬)顆粒免疫多種動物模型已經證實對埃博拉病毒感染有保護作用。水泡性口炎病毒(VSV)(重組病毒屬)委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)(α病毒屬)可以表達埃博拉病毒的糖蛋白。并且,水泡性口炎病毒的糖蛋白顆粒已經進入了Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗,這證實了它具有良好的安全性和埃博拉免疫原性。而用表達包膜蛋白域3(ED3)的麻疹病毒免疫的小鼠可以免受登革病毒的侵害。有趣的是,用miRNA序列的基因沉默方法已經被用于VEE,顯示它可以在動物模型中下調VEE的復制。在另一個研究中,作為VEE復制的關鍵的VEE RNA依賴性RNA多聚酶,在靶向針對它的5種miRNA中有3種可以成功抑制VEE在BHK細胞中的復制。許多與腫瘤免疫相關的研究都證實了自體擴增RNA病毒可以誘發腫瘤退行性改變,延長生存期甚至在幾種腫瘤的動物模型中起到保護作用。例如,庫金病毒顆粒表達的GM-CSF使小鼠黑色素瘤模型發生了退行性改變。而表達PSCA(前列腺干細胞抗原)的VEE粒子在前列腺癌模型中表現出保護作用。在應用了SFV介導轉運的神經特異性miR-124后在異種移植腦腫瘤的小鼠模型中得到了生存期延長的結果。有趣的是,僅一次肌內注射裸SFV-LacZ RNA就可以對患有CT26結腸癌的小鼠提供有效的保護。近期發現,用自體擴增RNA向量免疫可以在注射部位早期誘導產生大量的1型IFN和IFN免疫反應,這也許可以起到佐劑的效果或下調抗原表達。根據IFN受體敲除小鼠的研究,降低早期1型IFN反應可以有效提高自體擴增RNA向量的初始表達。另一個研究是與自體擴增復制子RNA和納米科技結合相關的。用殼聚糖納米粒子包裹復制子RNA大大提高了向樹突狀細胞(DCs)轉運的效率也增強了誘導體內免疫反應的效果。并且,為了避免引起宿主對自體擴增RNA病毒的中間體dsRNA的免疫反應,編碼保護病毒免疫入侵的蛋白E3,K3,B18的不可復制mRNA被一同轉運進入體內。這個方法大大的抑制了蛋白激酶R和IFN通路的激活同時增強了自體擴增RNA的表達和轉運。而針對有轉移性去勢抵抗性前列腺癌的病人應用由VEE顆粒介導表達的前列腺特異性膜抗原(PSMA)的Ⅰ期臨床試驗已經展開。在應用劑量為0.9×107或者0.36×108IU的VEE-PSMA顆粒后沒有觀察到毒性反應。盡管并沒有獲得PSMA特異性細胞免疫反應或臨床效果,但產生的中和性抗體表明在實驗中運用的劑量是可選的。關于將脂質體包裹的表達IL-2的SFV粒子應用于黑色素瘤和腎癌的病人的研究也進入了Ⅰ期臨床試驗。靜脈注射使IL-2在細胞質內的水平提高了5-10倍,并可以持續5天。有了包裹的過程,SFV顆粒不能被宿主免疫系統識別,使病人可以反復接受注射。最大耐受計量被定為每平方米3×109個顆粒。

 RNA藥物升級

 許多RNA類藥物已經進入臨床試驗階段。其中很大一部分是基于siRNA直接注射,脂質納米顆粒和包裹病毒顆粒的轉運方法。在這種情況下,在34個患有晚期實體腫瘤的病人身上進行了針對蛋白激酶N3的脂質體包裹siRNA的Ⅰ期臨床試驗。以10為單位的遞增梯度劑量通過靜脈注射進入病人體內同時用CT或MRI監測他們的反應。這種siRNA轉運有很好的耐受性而且僅引起了很低的毒性反應。41%的病人病情都比較穩定,其中8個病人在病情穩定的基礎上表現出部分或完全的轉移灶退行改變。而且,針對心血管疾病和罕見肝病的Ⅰ期臨床試驗也獲得了進展。目前,在慢性HBV感染者中針對通過脂質納米顆粒轉運的乙型肝炎病毒(HBV)的RNAi的Ⅱ期臨床試驗也取得了進展。利用針對半胱天冬酶2 mRNA的siRNAs來治療非動脈性早期缺血性視神經通路疾病也進入了Ⅲ期臨床試驗。人們也致力于尋找針對肺癌的RNA類精準藥物,也包括長效或短效用于診斷和治療的非編碼RNAs。生物標記物的臨床試驗可以為治療肺癌提供更好的方法。Moderna 有許多針對流感病毒,寨卡病毒和企昆貢亞病毒等感染性疾病的mRNA類藥物都在進行臨床試驗(主要是Ⅰ期臨床試驗)。

 RNA疫苗的進展

 RNA類疫苗最新的進展主要集中在脂質納米顆粒包裹的RNA和自體擴增RNA病毒向量應用的方面。例如,核苷改造的寨卡病毒 prM和E糖蛋白RNA分子已經應用脂質納米顆粒來包裹。單支低劑量皮下注射即可在小鼠及其它非人靈長類動物體內誘導產生強烈而持久的中和性抗體。在小鼠和非人靈長類動物體內誘導寨卡病毒保護性抗體的劑量分別是30微克和50微克。自體擴增RNA向量如昆金病毒和VEE也保護了注射致命病毒劑量的豚鼠不受埃博拉病毒的感染。同樣,用能表達人猿免疫缺陷病毒gag-pol的昆金病毒顆粒免疫的小鼠可以免受人猿免疫缺陷病毒的侵害。至于RNA藥物,通過確定腫瘤病人體內個體特異性腫瘤突變來生產的分子優化疫苗取得了巨大進步。在這種情況下,靈活的個體化腫瘤疫苗已經進入臨床試驗階段。在結內應用合成RNA疫苗的基礎上,由RNA脂質復合體納米顆粒改造的第二代RNA疫苗已經進入臨床試驗。例如,RNA脂質復合體納米顆粒(lipoMERIT)編碼的侵襲性黑色素瘤共有腫瘤抗原免疫療法已經在進行臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗的檢測。正在進行研究的預測數據顯示在40多個病人身上都獲得了良好的安全性和耐受性。疫苗誘導免疫反應陽性率很高而且多次注射Lipo-MERIT可以反復誘導產生抗原特異性免疫反應同時增強免疫前狀態。

 結語和展望

 RNA類生物藥物和疫苗在藥物界是一個相對比較前沿的技術。但是,它們的應用范圍極廣,包括在糖尿病,腫瘤,結核,心血管疾病和感染性疾病等疾病預防性和治療性的應用方面的潛能。盡管700多種RNA和DNA治療性藥物中大部分都處于臨床前期研發階段,只有小部分進入了臨床試驗,但據估測在2020年它將會占據12億市值。全球目前有160家公司和65家科研團隊涉獵RNA分子類的治療方案。迄今為止至少有12種mRNA疫苗正在研發。并且相較于DNA類藥物,RNA藥物更具潛力。特別是之前研制的寡核苷酸類藥物,對RNA病毒和mRNA基礎上研制的藥物和疫苗會大有助益。如今,對RNA類藥物和疫苗來說,有關于毒性和藥物轉運的問題仍亟待解決,但近期通過RNA分子包裹和自體擴增RNA病毒的應用增強了RNA穩定性并解決了轉運問題,讓這類藥物在未來藥物發展成為可能。

 本文分享自生物制品圈《RNA類藥物以及疫苗的研究進展》