圍繞mRNA疫苗AVT給您分享這些資訊,脂質體遞送有何優勢?

文章來源:AVT發布時間:2020-09-10瀏覽次數:

 本期AVT小編將圍繞mRNA疫苗,從遞送、給藥、專利三個方面分享mRNA疫苗相關資訊,那么脂質體遞送有何優勢?感興趣的小伙伴快來了解下!

 1990 年,Woiff 等首次證實,體外合成的 mRNA 經肌肉注射至小鼠體內后有活性蛋白產生。這就是 mRNA 疫苗的雛形。

 但mRNA自身穩定性差、易被體內的核酸酶降解是制約其發展的瓶頸。因此,mRNA 疫苗需要有合適的遞送載體將其遞送至體內,才能有更好的免疫效果,開發高效無毒的遞送系統是 mRNA 疫苗成功的關鍵。

 生輝此前已經總結了上述幾類 RNA 藥物的要點(點擊查看《瓶頸》)。本文將著重分析 mRNA 疫苗的遞送究竟有那幾道難題要解答?

 第一題:遞送載體

 相比于 DNA 疫苗,mRNA 疫苗無需進入細胞核,無整合到基因組的風險,相對更安全。mRNA 疫苗既可作為預防性疫苗預防流感等感染性疾病,也可作為治療性疫苗治療如癌癥等重大疾病。

 目前 mRNA 疫苗主要包括非復制型 mRNA 和病毒衍生的自我擴增型 mRNA(self-amplifying mRNA, SAM,圖 1)。


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 圖丨非復制型 mRNA(A)和病毒衍生的自我擴增型 mRNA(SAM)(B)結構組成(來源:J Int Pharm Res,Vol.46,No.5,May,2019 )


 非復制型 mRNA 是利用體外轉錄技術合,與真核生物 mRNA 分子結構一致,主要由 5'非翻譯區(untranslated region, UTR)、開放閱讀框(open reading frame, ORF)、3'非翻譯區、5'帽子結構(Cap)和 100-250bp 多聚腺苷酸尾巴(Poly (A))組成。5'-UTR 和 3'-UTR 中的調節元件可穩定 mRNA 并增加抗原蛋白質翻譯。ORF 是含有編碼抗原的核酸序列,Cap 能使 mRNA 沿著正確的方向進行翻譯。Poly (A)能增加 mRNA 的穩定性和抗原蛋白的表達,對 mRNA 的翻譯和穩定性具有重要作用,可經 Poly (A)聚合酶添加到 mRNA 上。mRNA 的合成一般是以含靶蛋白 ORF 的質粒為模板,經體外轉錄合成,最后再加上 5'Cap 和 3'端 Poly (A)。體外合成的 mRNA 進入細胞后,在核糖體上進行翻譯,形成功能性蛋白。

 病毒衍生的自我擴增型mRNA(SAM)是將編碼抗原的核酸序列直接插入單鏈 RNA 病毒中(如塞姆利基森林病毒、黃熱病毒等),通常相對分子質量比較大,能表達大量的抗原。目前使用的 SAM 疫苗大多基于甲病毒基因組,其中編碼 mRNA 復制機制的基因是完整的,只是編碼結構蛋白的基因被目的基因替換,利用 DNA 模板經體外轉錄技術即易得到。

 mRNA疫苗遞送載體主要包括病毒載體和非病毒載體。以慢病毒、腺相關病毒、仙臺病毒等載體為主的病毒載體雖能進行核酸遞送,但可能會因載體引起的免疫反應而受到限制,影響其應用。

 而非病毒載體主要包括脂質體、樹突細胞(dendritic cell, DC)、無機納米粒子、陽離子細胞穿膜肽等。其中,脂質體遞送 mRNA 具有獨特優勢: 1)脂質體為球形囊泡,可將 mRNA 包裹在內,抵御核酸酶的作用;2)脂質體類似于細胞膜,易與受體細胞融合,轉染效率高;3)脂質體可遞送不同大小片段的 mRNA;4)脂質體作為遞送載體不受宿主限制。截至目前,脂質載體已成為遞送 mRNA 最為有效的非病毒載體。常用的遞送 mRNA 的脂質體材料見表 1。


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 (來源:J Int Pharm Res,Vol.46,No.5,May,2019)


 目前,用于遞送mRNA的非病毒載體中以脂質體應用的最為廣泛,主要包陽離子括脂質體復合物 (lipoplex,LP)、脂質體聚合物(lipopolyplex,LPR)、脂質體納米粒(lipid nanoparticle,LNP)、陽離子納米乳(cationic nanoemulsion,CNE)等。

 最早使用的脂質體遞送材料是陽離子脂質體。帶正電荷的陽離子脂質體與帶負電荷的 mRNA 通過經靜電作用聚集形成多層囊狀復合物,稱為脂質體復合物 (lipoplex,LP),復合物中包封的 mRNA 不易被 RNase 降解,能被成功遞送至細胞翻譯成功能性蛋白。2-二油?;u丙基 - 3-N,N,N - 三甲銨氯(DOTAP) 和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE) 是已被證實有效的遞送載體。

 陽離子聚合物具有濃縮mRNA的作用,mRNA與聚合物濃縮后被陽離子脂質體包裹在囊狀空腔中則形成脂質體聚合物(lipopolyplex,LPR)。LPR 最早用于DNA轉染,后來也用于siRNA和mRNA轉染。

 脂質體納米粒LNP一般由被脂質雙層殼包圍的水性核心組成,脂質雙層殼由不同的脂質組成,每種脂質都發揮著不同的功能。LNP 是目前主流的遞送載體之一,然而,早期的陽離子 LNP 在體內的應用仍然受到很大限制,比如容易被巨噬細胞清除和產生有害的活性氧簇 ROS 等。

 為了解決這些問題,“可離子化”LNP 的概念被提出。雖然大大促進了核酸藥物的發展,但仍然不盡人意。納米顆粒的體積比較大,一般需要靜脈注射,只能有效進入肝臟,脾臟和腫瘤等空隙較大的組織。另外,LNP 的過敏反應也比較嚴重,在注射之前需要使用抗組胺和激素藥物控制。這些缺點讓 LNP 藥物只適用于罕見病和癌癥等嚴重疾病。

 Brito 等使用陽離子納米乳 (cationic nanoemulsion,CNE) 遞送不同種類的 SAM 疫苗,該 CNE 配方是基于諾華專利佐劑 MF59。相比于 LNP,CNE 已用于臨床試驗,具有更重要的臨床意義。

 即使許多藥物(如生化藥物抗癌抗真菌藥物、基因藥物、麻醉劑)通過脂質體進行遞送,并取得了成功,但是由于脂質體本身存在一些缺點,如易氧化降解、制備重現率差等,大規模工業化生產不易實現等問題都有待解決,同時由于傳統脂質納米粒的開發過程進展緩慢,目前開發出來的有效遞送載體非常有限。

 而遞送載體只是待破解的難題之一,與其正相關的給藥機制同樣不明朗。

 第二題:給藥方式

 mRNA 疫苗的給藥方式非常重要,會決定mRNA疫苗在體內的代謝,及目的抗原蛋白翻譯的效率。例如,如果直接靜脈注射未經任何處理的裸露 mRNA,就會被血液中的核酸酶迅速降解。

 mRNA 疫苗的給藥分為系統給藥或者局部給藥,根據抗原蛋白需要表達的位置來決定(下圖所示為系統給藥和局部給藥)。如果是預防性疫苗,為了引起較強的免疫反應,通常用皮下和肌肉注射的局部給藥,如果是治療性 mRNA 疫苗通常通過腹腔或者靜脈注射系統給藥。


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 圖丨系統給藥和局部給藥(來源:Biomaterials for mRNA delivery)


 同時,對于脂質體遞送 mRNA 來說,不同的給藥途徑對誘導蛋白表達、給藥頻率及副作用強度具有重要影響。如 LNP 遞送可通過改變給藥途徑來改變 mRNA 體內表達量和持續時間,其中,肌注和皮內注射顯示出比靜脈注射更持久的蛋白表達。

 研究表明,脂質體主要的給藥方式有以下 5 種類。

 1)靜脈注射。一種全身給藥的方式,藥物經血液流經全身,藥效發揮迅速,也是脂質體遞送 mRNA 常用的給藥方式。脂質體在靜脈注射后首先被富含網狀內皮細胞的組織 (肝、脾) 攝取,而后被單核巨噬細胞吞噬,少量被肺、骨髓攝取。因進入血液中的脂質體大小及電荷不同,其在血液中清除速率也不一樣,大的脂質體清除速率要比小的快。靜脈注射不可避免的缺點是脂質體中若殘留有制備時產生的毒性溶劑,會對機體產生比其他給藥方式更大的副作用。

 2)皮下注射。是常規疫苗接種第二種最常用的給藥方式。皮下注射是將 mRNA 遞送至皮膚和骨骼肌之間,這種給藥方式可直接轉染 mRNA 至淋巴結中的 DC,但皮下注射對劑量有一定的限制,若給藥劑量過多需要分點注入,操作難度大。

 3)肌肉注射。將 mRNA 遞送至肌肉組織內。這種給藥方式的優點是容易實現大劑量給藥,但對粒徑和電荷具有特殊的要求,粒徑和電荷較大則會減少遞送,影響藥效。

 4)皮內注射??芍苯訉⒅|體遞送至表皮和真皮之間。表皮和真皮之間具有大量免疫細胞(朗格漢細胞、DC 亞型),皮內注射給藥可有效誘導 Th1(輔助性 T 細胞 1) 型免疫應答。但其與皮下注射缺點相同,均無法實現大劑量給藥,需要分點注射或多次給藥才能達到所需治療劑量。

 5)DC 細胞的轉染。mRNA 疫苗另外一種非常重要的給藥方式是通過 DC 細胞的轉染進行給藥,分為體內和體外兩種 DC 細胞介導的方式。DC 細胞是人體重要的抗原遞呈細胞,其攝取抗原后可以誘導隨后的免疫反應。在體外分離得到人體未成熟的 DC 細胞后,可以通過電穿孔技術轉染 mRNA,再把轉染后的 DC 細胞過繼入人體,產生被動免疫。

 但是通過體外 DC 轉染的方式遞送 mRNA 疫苗對技術的要求非常高,需要較長的體外培養時間,而且首先需要獲取人體的 DC 細胞,在普通條件下難以實現。另外一個通過 DC 細胞給藥的方式是淋巴內給藥,mRNA 被直接注射到淋巴內,這樣 mRNA 就可以被淋巴內固有 DC 細胞獲取,但是這種給藥方式通常需要手術輔助,導致給藥非常復雜且帶了大量的風險。

 綜上所述,以上 5 種給藥方式雖為常用的疫苗給藥方式,但具有各自的優缺點,使用哪一種給藥方式要根據具體情況分析。

 現階段,受制于遞送效率,mRNA 分子只有極少(0.01%)能成功進入細胞質并表達蛋白,因此大劑量給藥仍是常態,將會帶來較大的副作用。只有選擇合適的給藥方式,脂質體才能更好遞送 mRNA,使其以更小的劑量、更少的副作用,激發起更大的免疫效果。

 第三題:專利護城河

 全球范圍內,尚無基于 mRNA 技術平臺研發的治療或預防性藥物、疫苗獲批上市。國外有“mRNA 疫苗研發三巨頭”:Moderna、CureVac、BioNTech,均采用脂質納米技術遞送(LNP),這也是目前在核酸藥物領域應用比較廣泛的遞送技術類型。

 其中,Moderna 專注于 mRNA 藥物的開發。這家公司 2010 創立;2011 年正式運行;2018 年上市,創造了美股史上最大生物科技公司 IPO 記錄。但技術、專利本身存在的問題讓 Moderna 一直處于風口浪尖。

 最核心的爭議是 Moderna 的核心技術及其專利保護能力。

 首先是mRNA藥物最為關鍵的遞送問題。Moderna 最初使用的脂質體技術會激活強烈的炎癥反應和肝毒性 (特別是在重復注射時),直接導致了早期產品線的失敗。

 Moderna 宣稱在后續產品使用了自己開發的新型脂質體遞送技術,然而,首個質疑的聲音來自 Arbutus——Arbutus 懷疑 Moderna 至少在兩個最領先的產品中非法使用了 Arbutus 的 LNP 遞送技術,隨后 Arbutus 提出了一場關乎 Moderna 關鍵產品命運的法律訴訟。

 Moderna 先后 4 次從獲得 Arbutus 授權的 Acuitas 取得 LNP 技術的使用資格,然而,根據當初 Arbutus 與 Acuitas 的授權協議,Acuitas 只在“antisense”和“gene therapy” 兩個領域擁有 LNP 技術的使用和二次授權權利,同時還限定了在二次授權時,所授權的產品必須由 Acuitas 開發、并已在動物模型中完成初步驗證。因此,Arbutus 指控 Moderna 與 Acuitas 的授權協議涉嫌重大違約:Acuitas 將所有基于 LNP 技術的專利和技術要點都授權給 Moderna,而不是當初限定的兩個治療領域,也不是由 Acuitas 開發并完成臨床前驗證的產品。

 2018 年 2 月,裁定結果剝奪了 Acuitas 繼續使用和二次授權 LNP 技術的權益,Moderna 可以慶幸的是雖然無法在其他領域使用 LNP 技術,之前獲得授權的 4 個產品仍然保留了使用權,Moderna 將向 Arbutus 支付費用。

 Moderna 申明現在使用的是公司內部研發的新型脂質體遞送技術,但 Arbutus 表示根據 Moderna 所發表的文獻、報告和專利分析提出,Moderna 很難在不依靠 Arbutus 專利的情況下,開發出有效的脂質體遞送技術。因此,不能排除 Moderna 將繼續陷入專利戰的可能。

 Moderna 的核苷修飾技術則是另一專利糾紛的焦點。

 體外合成的mRNA具有較高的免疫原性,可能會誘發大量炎癥反應。人體對 mRNA 的免疫反應主要和尿苷 (部分由尿嘧啶組成)有關,而利用假尿嘧啶替代尿嘧啶就能夠減少免疫系統對 mRNA 的識別,這種修飾策略最初由賓夕法尼亞大學發明并最終將專利賣給了 Cellscript。

 Moderna 在成立之初的重點之一,就是找到能夠繞開假尿嘧啶專利的新的修飾方法,并且似乎是成功了——Moderna 找到了 1 - 甲基假尿嘧啶,并終于在 2014 年獲得了多項專利授權。但令人玩味的是,2017 年 6 月,Moderna 仍然選擇了從 Cellscipt 購買假尿嘧啶核苷修飾方法的專利使用權,并為此先期支付了 7500 萬美元的專利使用費,以及后續每個產品 2600 萬美元的里程碑付款和個位數的銷售提成。Moderna 現在的產品線是否有專利護城河保衛,令人生疑。

 生輝觀點

 mRNA 疫苗生產工藝簡單、合成快速、成本較低,本身具有激活免疫反應的佐劑作用。Moderna、CureVac 等公司融資金額已經很高,但最快的臨床試驗僅進展到 II 期,由于動物環境和人體環境差異較大,遞送系統在人體內效率、mRNA 穩定性等都需要大量臨床實驗予以進一步驗證。

 國內方面,依托于重大高??蒲袑@?,斯微 (上海) 生物科技有限公司﹑艾博生物醫藥(杭州)有限公司﹑上海藍鵲生物醫藥有限公司在新冠疫苗的研發方面取得重要進展,盡管尚未進入臨床試驗階段,安全性和有效性有待確認。

 當前,mRNA 疫苗的研究還集中于增強其穩定性、調節其免疫原性、發展新的傳遞技術、拓展更廣的疾病治療范圍等方面,開發出成熟的藥物仍有待時日。

 參考

 https://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/rna.22269

 http://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=e28268d4b63ddb3b22270ea1763b2892&site=xueshu_se

 http://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=e28268d4b63ddb3b22270ea1763b2892&site=xueshu_se

 http://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=a985458fdb64a87549d6f241ee836675

 本文內容分享自知乎文章《mRNA疫苗的三道必答難題:遞送、給藥、專利》作者:DeepTech深科技